細胞(bao)培養(yang),既包(bao)括微生物(wu)細胞(bao)的培養(yang),細胞(bao)培養(yang)技術(shu)可(ke)以由壹個細胞(bao)經過(guo)大量培養(yang)成(cheng)為簡(jian)單(dan)的單(dan)細胞(bao)或極(ji)少(shao)分(fen)化(hua)的多細胞(bao),這是(shi)克(ke)隆(long)技術(shu)重(zhong)要的環節,細胞(bao)培養(yang)本身就(jiu)是(shi)細胞(bao)的克隆(long)。通(tong)過細胞(bao)培養(yang)得(de)到大(da)量的細胞(bao)或其代謝產(chan)物(wu)。因(yin)為生(sheng)物(wu)產(chan)品(pin)都(dou)是(shi)從(cong)細胞(bao)得來,所以(yi)可(ke)以(yi)說(shuo)細胞(bao)培養(yang)技術(shu)是(shi)生(sheng)物(wu)技術(shu)中(zhong)最(zui)核(he)心(xin)、最(zui)基(ji)礎(chu)的技術(shu)。細胞(bao)培養(yang)方(fang)法(fa)：

1、細胞(bao)傳代：

細胞(bao)密度達到(dao)80-90%時即可(ke)傳(chuan)代。

1、棄去培養(yang)上(shang)清(qing)，用(yong)PBS或生理鹽(yan)水(shui)清(qing)洗(xi)1-2次；

2、加入2ml0.25%（T25瓶），使覆(fu)蓋整個瓶或(huo)皿，蓋(gai)好(hao)放(fang)入培養(yang)箱消(xiao)化(hua)；

3、1-2min後，顯(xian)微鏡下觀察細胞(bao)，若大(da)部(bu)分(fen)細胞(bao)回(hui)縮(suo)且(qie)有(you)少量細胞(bao)脫(tuo)落，輕(qing)輕(qing)吹打(da)下確認消(xiao)化(hua)情況(kuang)後加入全(quan)培養(yang)基(ji)終止消(xiao)化(hua)；若細胞(bao)還(hai)是(shi)貼(tie)壁(bi)，放回(hui)培(pei)養(yang)箱繼(ji)續消(xiao)化(hua)至可(ke)以輕(qing)輕(qing)吹打(da)下為止；

4、將(jiang)細胞(bao)懸(xuan)液1000RPM左右(you)條件下離(li)心(xin)4min，棄上(shang)清(qing)；

5、用新(xin)鮮(xian)培養(yang)基(ji)重(zhong)懸(xuan)後加入培(pei)養(yang)瓶或(huo)皿中(zhong)，T25培養(yang)瓶加(jia)6-8ml培養(yang)基(ji)；

6、懸(xuan)浮(fu)細胞(bao)直接離(li)心(xin)收集(ji)，細胞(bao)沈澱(dian)重(zhong)懸(xuan)後分(fen)到新(xin)培養(yang)瓶中(zhong)。

①棄去培養(yang)上(shang)清(qing)，用(yong)PBS或生理鹽(yan)水(shui)清(qing)洗(xi)1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆(fu)蓋整個瓶或(huo)皿，蓋(gai)好(hao)放(fang)入培養(yang)箱消(xiao)化(hua)；

③1-2min後，顯(xian)微鏡下觀察細胞(bao)，若大(da)部(bu)分(fen)細胞(bao)回(hui)縮(suo)且(qie)有(you)少量細胞(bao)脫(tuo)落，輕(qing)輕(qing)吹打(da)下確認消(xiao)化(hua)情況(kuang)後加入全(quan)培養(yang)基(ji)終止消(xiao)化(hua)；若細胞(bao)還(hai)是(shi)貼(tie)壁(bi)，放回(hui)培(pei)養(yang)箱繼(ji)續消(xiao)化(hua)至可(ke)以輕(qing)輕(qing)吹打(da)下為止；

④將(jiang)細胞(bao)懸(xuan)液1000RPM左右(you)條件下離(li)心(xin)4min，棄上(shang)清(qing)；

⑤用新(xin)鮮(xian)培養(yang)基(ji)重(zhong)懸(xuan)後加入培(pei)養(yang)瓶或(huo)皿中(zhong)，T25培養(yang)瓶加(jia)6-8ml培養(yang)基(ji)；

⑥懸(xuan)浮(fu)細胞(bao)直接離(li)心(xin)收集(ji)，細胞(bao)沈澱(dian)重(zhong)懸(xuan)後分(fen)到新(xin)培養(yang)瓶中(zhong)。

2、細胞(bao)復蘇：

①將(jiang)凍(dong)存(cun)管在(zai)37℃溫水中(zhong)快速(su)搖(yao)晃融(rong)化(hua)，時間(jian)1min左右(you)，加入(ru)4-5ml培養(yang)基(ji)混(hun)勻。

②在(zai)1000RPM左右(you)條件下離(li)心(xin)4min，棄上(shang)清(qing),加1-2ml培養(yang)基(ji)吹(chui)勻，將(jiang)細胞(bao)懸(xuan)液加入培養(yang)瓶中(zhong)，補加(jia)適量培養(yang)基(ji)。

3、細胞(bao)凍存：

待細胞(bao)生長(chang)狀(zhuang)態良好時(shi)進(jin)行細胞(bao)凍存保種(zhong)

①棄去培養(yang)上(shang)清(qing)，用(yong)PBS或生理鹽(yan)水(shui)清(qing)洗(xi)1-2次，加(jia)入(ru)1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min後，顯(xian)微鏡下觀察細胞(bao)，大部分(fen)細胞(bao)回(hui)縮(suo)且(qie)有(you)少量細胞(bao)脫(tuo)落，輕(qing)輕(qing)吹打(da)下確認消(xiao)化(hua)情況(kuang)後加入全(quan)培養(yang)基(ji)終止消(xiao)化(hua)；

③將(jiang)細胞(bao)懸(xuan)液1000RPM左右(you)條件下離(li)心(xin)4min，棄上(shang)清(qing)，加(jia)1ml凍存液重(zhong)懸(xuan)細胞(bao)；

④將(jiang)凍(dong)存(cun)管放入程序降溫盒，放(fang)入(ru)-80℃冰(bing)箱，4小時後將(jiang)凍(dong)存(cun)管轉入液氮罐(guan)儲(chu)存(cun)。