聚(ju)合(he)酶(mei)鏈反應(ying)(PCR)技術是(shi)在(zai)體外(wai)進(jin)行(xing)的由引物介導的(de)酶(mei)促DNA擴增反應(ying)。PCR的原(yuan)理是在(zai)模板DNA、PCR引(yin)物、四(si)種脫(tuo)氧(yang)核(he)糖(tang)核(he)苷酸(suan)(dNTP)及(ji)適當濃度(du)的Mg2+存(cun)在(zai)的條(tiao)件下(xia)，依(yi)賴於DNA聚(ju)合(he)酶(mei)的體外(wai)酶(mei)促合(he)成反應(ying)。根據PCR使(shi)用說(shuo)明(ming)進行(xing)試劑(ji)混合(he)預(yu)配，並設置 PCR 循環。簡而言之，PCR需(xu)要經過以下(xia)循環(huan)：

1. 初(chu)始(shi)化步(bu)驟

這僅對(dui)熱(re)啟(qi)動 PCR 必(bi)不ke少(shao)。此步(bu)驟將溶液加(jia)熱(re)至 94-98°C，以激(ji)活 DNA 聚(ju)合(he)酶(mei)。該(gai)步驟的(de)時間取(qu)決(jue)於(yu)所使(shi)用的聚(ju)合(he)酶(mei)。

2. 變性步驟

DNA是雙鏈(lian)分子(zi)，DNA擴增需(xu)要引物與(yu)單(dan)鏈(lian)DNA模板相互(hu)作用(yong)。在(zai)此步(bu)驟中(zhong)，將反應(ying)混合(he)物加熱(re)至 94-98°C 並保(bao)持 20-30 秒，以破壞(huai)兩條(tiao)鏈之間的氫(qing)鍵並生(sheng)成單鏈 DNA 分子(zi)。此時(shi)進入 PCR 循(xun)環(huan)。

3. 退火步驟

變性後，反應(ying)混合(he)物中的(de) DNA 模板是(shi)單(dan)鏈的(de)。由於引(yin)物與(yu)DNA模板互(hu)補(bu)，當反應(ying)溫度(du)降(jiang)低(di)到50-65℃時，引物會(hui)與(yu)模板序(xu)列(lie)匹(pi)配，互(hu)補(bu)堿(jian)基之間形成氫(qing)鍵。退火溫度(du)取(qu)決(jue)於(yu)所用引物的Tm，壹般(ban)比引(yin)物Tm低3-5℃左(zuo)右(you)。該(gai)步驟將持續(xu)約(yue) 20-40 秒以wan全退火，然(ran)後聚(ju)合(he)酶(mei)將定位(wei)到引物-模板雜(za)交體以(yi)開(kai)始(shi) DNA 組(zu)裝。

4. 伸長步(bu)驟

在(zai)此步(bu)驟中(zhong)，DNA 聚(ju)合(he)酶(mei)開(kai)始(shi)合(he)成 DNA，因(yin)此溫度(du)應(ying)為 DNA 聚(ju)合(he)酶(mei)的最(zui)適(shi)溫度(du)。壹般(ban)選(xuan)擇(ze) 72°C，但(dan)有些(xie)酶(mei)在(zai) 68°C 時效(xiao)果(guo)更好。這(zhe)壹步與(yu)體內(nei)DNA復(fu)制非(fei)常相似(si)，DNA聚(ju)合(he)酶(mei)將dNTPs添加到引物中，以(yi)5'到3'方(fang)向與(yu)模板互(hu)補(bu)，最(zui)終(zhong)產生(sheng)新(xin)的雙(shuang)鏈(lian)DNA片(pian)段。延伸時(shi)間取(qu)決(jue)於(yu)目(mu)標(biao) DNA 片(pian)段的長(chang)度(du)和 DNA 聚(ju)合(he)酶(mei)的能(neng)力。壹般(ban)來說(shuo)，DNA 聚(ju)合(he)酶(mei)每 60 秒產生(sheng)壹千個堿(jian)基。

5. 2~4步稱為(wei)壹個循(xun)環(huan)，每循(xun)環壹次，目(mu)標(biao)片(pian)段量翻(fan)倍(bei)。壹個 PCR 過程使(shi)用 30-35 個循(xun)環(huan)。在(zai) PCR 循環(huan)的(de)早(zao)期，PCR 產物以指數速(su)率(lv)積累(lei)，而在(zai) PCR 循環(huan)的(de)後(hou)期，隨(sui)著(zhe) dNTPs、引(yin)物的減少和 DNA 聚(ju)合(he)酶(mei)在(zai)變性溫度(du)下(xia)的失活(huo)，反應(ying)減慢，PCR 速(su)率(lv)逐漸下(xia)降。

6.最(zui)終(zhong)伸(shen)長(chang)率(lv)。30-35個循(xun)環(huan)結(jie)束後(hou)，在(zai)68-74℃的溫度(du)下(xia)最(zui)終(zhong)延伸約(yue)5-10分鐘(zhong)，以充(chong)分延伸剩(sheng)余(yu)的單(dan)鏈DNA。

7.貯(zhu)存(cun)。最(zui)終(zhong)產品可以在(zai) PCR 機器中維持溫度(du)在(zai) 4-10°C。